Estudo comparativo das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 sobre canais de sódio

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Estudo comparativo das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 sobre canais de sódio

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Title: Estudo comparativo das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 sobre canais de sódio
Author: Alessandra Cristine de Souza Matavel
Orientador: Paulo Sergio Lacerda Beirao
Co-orientador: Jader dos Santos Cruz
Banca:
Presidente: Paulo Sergio Lacerda Beirao
Co-orientador: Jader dos Santos Cruz
Subject: Phoneutria nigriventer Teses; Toxinas Teses.; Canais de sódio Teses.; Bioquímica Teses.
Palavra-chave: Bioquímica e Imunologia
Date: 14-01-2004
Publisher: UFMG
Abstract: A aranha Phoneutria nigriventer é uma das principais responsáveis por acidentes de araneismo na região sudeste do Brasil. Os sintomas predominantes causados por sua peçonha resultam em hiperexcitabilidade geral. Duas toxinas presentes no veneno, a Pntx2-5 e a PnTx2-6 possuem 48 resíduos de aminoácidos cada, com peso molecular de 5112,3 e 5289,3 Da, respectivamente. A toxina PnTx2-6 foi considerada o componente mais tóxico do veneno da aranha, por apresentar efeitos similares aos do veneno total, modificando os canais de sódio. Por se diferirem em apenas cinco resíduos de aminoácidos, comparamos os efeitos das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 em canais de sódio de células GH3, alem de comparar os efeitos da PnTx2-6 em canais de sódio de diferentes tipos celulares (neuronal e muscular esquelético). Nossos dados mostram que ambas as toxinas aumentam a constante de tempo para a inativação dos canais de sódio em todas as preparações estudadas, com o surgimento de um componente que não inativa. Além disso, em músculo esquelético de rã, a PnTx2-6 reduz a amplitude da corrente de sódio, desloca as curvas de ativação e estado estacionário da inativação para valores hiperpolarizados e aumenta o tempo necessário para a recuperação da corrente de sódio. A afinidade da PnTx2-6 em sarcolema de rã foi 25 vezes menor que em células GH3. Nessas células, a PnTx2-6 modificou os parâmetros relacionados à inativação dos canais de sódio (a curva do estado estacionário da inativação e a recuperação da inativação da corrente de sódio) e o tempo para o pico da corrente. A PnTx2-5 modificou a curva de inativação no estado estacionário, mas não modificou o tempo para o pico e a recuperação da corrente de sódio. As toxinas da aranha não alteram a amplitude da corrente de sódio em células GH3. Uma diferença que nos chamou a atenção entre a PnTx2-6 e a PnTx2-5 em células GH3 foi a diferença em suas afinidades: o K0,5 da PnTx2-6 é 3 vezes menor que da PnTx2-5. Além disso, a PnTx2-5 se liga de forma reversível, sendo lavada do seu sítio ativo. Quando a célula é fortemente despolarizada esta toxina se desliga mais rápido. A PnTx2-6 não se deslocou do seu sítio ativo em nossas condições experimentais, nem mesmo com fortes despolarizações. A análise do dicroísmo circular da Pntx2-6 sugere que ela seja formada predominantemente por folhas- e estrutura randômica, apresentando baixa proporção de -hélice. O espectro de fluorescência do triptofano mostrou que estes resíduos estão expostos na superfície da molécula. Visto que um triptofano e uma tirosina estão substituídos na PnTx2-5, estes aminoácidos podem estar envolvidos na ligação da toxina ao canal de sódio, sendo importantes para conferir o maior K0,5 desta toxina quando comparada à PnTx2-6.
Resumo em lingue estrangeira: The spider Phoneutria nigriventer is the major responsible for the araneism accidents in the Southeast of Brazil. The predominant symptoms of the envenomation indicate a general hyperexcitability. Two toxins of the venom, PnTx2-5 and PnTx2-6 have 48 amino acids each, and molecular weight 5112.3 e 5289.3 Da, respectively. The toxin PnTx2-6 is the most toxic component of the spider venom, and produces similar effects of the whole venom, modifying the sodium channels. As PnTx2-5 and PnTx2-6 diverge in 5 amino acids, we compared their effects on the sodium channel currents of GH3 cells, and compared the effects of PnTx2-6 on sodium currents of neuronal and skeletal muscle fibers. The data show that both toxins increase the time constant of inactivation of sodium current in all preparation tested, and produce a non-inactivating component. Additionally, in frog skeletal muscle PnTx2-6 decreases the sodium channel current amplitude, shifts the activation and steady-state inactivation voltage dependences to hyperpolarized potentials, and increases the time for recovery from inactivation. The PnTx2-6 affinity in skeletal muscle is 25 times lesser than that of GH3 cells. In these cells, PnTx2-6 modified the parameters related to the inactivation of sodium channels (the voltage-dependence of steady-state inactivation curve and the recovery from the sodium current), and the time to peak of the current as well. PnTx2-5 modifies the steady state inactivation curve, but does not modify the time to peak nor the recovery from inactivation of the sodium current. The toxins do not modify the amplitude of the sodium channel in GH3 cells. The main difference PnTx2-6 and PnTx2-5 on GH3 cells was their affinities: the K0,5 of PnTx2-6 is 3 times smaller than PnTx2-5. In addition, PnTx2-5 binds reversibly and can be washed from its binding site. When the cell is strongly depolarized, this toxin unbind faster, However, PnTx2-6 is not displaced from its binding site in ours experimental condition, even after strong depolarization The circular dichroism analysis of Pntx2-6 suggests that its secondary structure is formed predominantly by -sheet and random coil, with a small proportion -helix. The tryptophan fluorescence spectra show that these residues are exposed on PnTx2-6. One tryptophan and one tyrosine are replaced in PnTx2-5 when compared to PnTx2-6, and these amino acids may be involved in the binding of the toxin to the sodium channel, and their absence may account for the difference of affinities.
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9W8GXY

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