Caracterização bioquímica e farmacológica de proteases do látex de carica candamarcensis com atividade mitogênica

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Caracterização bioquímica e farmacológica de proteases do látex de carica candamarcensis com atividade mitogênica

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Title: Caracterização bioquímica e farmacológica de proteases do látex de carica candamarcensis com atividade mitogênica
Author: Marco Tulio Ribeiro Gomes
Orientador: Carlos Edmundo Salas Bravo
Banca:
Presidente: Carlos Edmundo Salas Bravo
Co-orientador: Miriam Teresa Paz Lopes
Membro: Maria Luiza Vilela Oliva; Michael Richardson; Claudio Antonio Bonjardim; Silvia Passos Andrade
Subject: Bioquímica Teses.; Caricacea Teses.; Cisteína proteinase Teses.
Palavra-chave: Caricaceae; cisteíno protease; efeito mitogênico; MAP-quinases
Date: 13-08-2008
Publisher: UFMG
Abstract: O látex de Caricaceae é uma fonte tradicional de enzimas proteolíticas as quais são amplamente utilizadas na indústria e como preparações farmacológicas. Relatos etnofarmacológicos indicam que Carica candamarcensis, membro da família Caricaceae e comum a algumas áreas na América do Sul, é usada no tratamento de disfunções gástricas. É creditado às cisteíno proteases de Caricaceae funções defensivas na planta. Após injúria no epicarpo do fruto, essas enzimas iniciam um processo de coagulação semelhante ao que ocorre em mamíferos. Uma fração contendo proteases de C. candamarcensis estimulou a proliferação de células de mamíferos, sugerindo um papel na regeneração do tecido lesado. Também existem evidências que algumas enzimas auxiliam na cicatrização de úlceras gástricas e abrasões cutâneas realizadas em modelos murinos. Neste trabalho, nosso primeiro objetivo foi isolar e caracterizar proteases com atividade mitogênica presentes no látex de C. candamarcensis. Em seguida, visamos determinar a estrutura primária e terciária de uma dessas enzimas assim como analisar possíveis mecanismos de ação dessa substância. Após três processos cromatográficos foram isoladas duas cisteíno proteases (CMS2MS2 e CMS2MS3) com aproximadamente 23 kDa. CMS2MS2 estimulou a proliferação celular acima de 50% quando comparado ao controle em fibroblastos, osteoblastos e insulinoma. O efeito mitogênico foi observado com aproximadamente 1 nM de enzima e foi independente da atividade proteolítica quando avaliado em fibroblasto. Além disso, o inibidor específico de MEK (PD98059), que bloqueia a via das MAP-quinases, aboliu a atividade mitogênica de CMS2MS2. O efeito inibitório desse composto também foi observado quando CMS2MS2 esteve inibido por E-64. Entretanto, a proliferação celular foi apenas moderadamente diminuída (10%) quando fibroblastos foram pré-incubados com o inibidor do receptor de EGF (AG1478). Esse dado foi correlacionado com a liberação de fatores de crescimento das células com posterior atuação autócrina destas substâncias. CMS2MS2 possui 214 resíduos de aminoácidos incluindo os que formam a tríade catalítica (Cys25, His159 e Asn175). Análises filogenéticas revelaram que CMS2MS2 está mais próxima evolutivamente da quimopapaína do que da papaína, ambas isoladas do látex de Carica papaya. A estrutura tridimensional predita mostrou que essa enzima mitogênica possui características típicas das proteases da família da papaína. Estes dados sugerem que mínimas diferenças estruturais podem determinar seu efeito proliferativo, o qual é independente da atividade proteolítica; mas é dependente da ativação da via das MAP-quinases. A propriedade de agir como mitógeno atribuída às cisteína proteases isoladas de Caricaceae pode explicar algumas das aplicações farmacológicas destas proteases.
Resumo em lingue estrangeira: Latex from Caricaceae contains proteolytic enzymes localized in the fruit, which are widely used industrially as well as in pharmaceutical preparations. Ethnopharmacologically, Carica candamarcensis, a member of Caricaceae family common to many areas of South America, is used to treat digestive disorders. Cysteine proteinases from Caricaceae latex are believed to be part of a plant defense mechanism. Upon injury, these enzymes promote the formation of a protein clot around the wounded area, as it occurs with mammalian systems. Some of these proteins display proliferative properties when probed with mammalian cells suggesting a role in reconstruction of wounded tissue. There are evidences that some of these enzymes are able to protect and enhance healing of chemically induced gastric ulcers in rats. In addition, it was demonstrated that these proteinases enhance the healing rate of induced dermal abrasions. In this study, we first aimed the isolation and characterization of proteinases displaying mitogenic activity. Subsequently, our goals were to determine the structure of the mitogenic protein and analyze a possible mechanism of action of this molecule. After three chromatography steps we isolated two mitogenic cysteine proteinases (CMS2MS2 and CMS2MS3) displaying a relative mass of 23 kDa. CMS2MS2 at approximately 1 nM stimulates proliferation above 50% of the control levels on insulinoma, fibroblastic, and osteoblastic cells. The mitogenic activity of CMS2MS2 in fibroblast was not affected by its inhibition with E-64, a specific inhibitor of cysteine protease. Furthermore, a specific MEK inhibitor (PD98059), that blocks the MAP-kinases pathway, abolishes the mitogenic activity of CMS2MS2. This inhibitory effect was also observed when CMS2MS2 was inhibited with E-64. In addition, the mitogenic effect was slightly suppressed (10%) when fibroblasts were pre-incubated with AG1478, a specific inhibitor of the EGF-receptor kinase. This phenomenon was correlated with growth factors released from cells acting in an autocrine way. CMS2MS2 contains 214 residues including the catalytic triad composed by Cys25, His159, Asn175. A phylogenetic tree analysis demonstrated that CMS2MS2 ranks closer to chymopapain than to papain, both isolated from Carica papaya latex. The overall predicted three-dimensional structure is similar to proteases from the papain family. These results suggest that minor structural differences within CMS2MS2 must account for its proliferative action that is independent of its proteolytic activity; but it is mediated by activation of MAP-kinases. This mitogenic property attributed to a purified cysteine proteinase may explain some of the therapeutical actions attributed to these enzymes.
URI: http://hdl.handle.net/1843/CMFC-7RENZX

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