Caracterização cinética da inibição da calicreína tecidual do rato, isolada da glândula submandibular, com a aprotinina

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Caracterização cinética da inibição da calicreína tecidual do rato, isolada da glândula submandibular, com a aprotinina

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Title: Caracterização cinética da inibição da calicreína tecidual do rato, isolada da glândula submandibular, com a aprotinina
Author: Carolina Matias Diniz
Orientador: Amintas Fabiano de Souza Figueiredo
Banca:
Presidente: Amintas Fabiano de Souza Figueiredo
Membro: Edyr Rogana; Marcelo Matos Santoro
Suplente: Marinez de Oliveira Sousa
Subject: Bioquímica Teses.; Calicreína Teses.; Glândula submandibular Teses.; Farmácia Teses.
Palavra-chave: Calicreína tecidual de rato; Aprotinina; Inibição da calicreína tecidual do rato; Cinética enzimática
Date: 03-07-2008
Publisher: UFMG
Abstract: As calicreínas são um sub-grupo da família das serino-proteases conhecidas por apresentarem importantes funções fisiológicas dependentes dos tecidos e das circunstâncias de expressão. Elas são encontradas no pâncreas, glândulas salivares, intestinos, rins, glândula pituitária, plasma, soro e outros tecidos. Evidências sugerem que as calicreínas teciduais estão envolvidas em diferentes processos patológicos, incluindo doenças no Sistema Nervoso Central, tais como epilepsia, Alzheimer e câncer, sendo, portanto, futuras candidatas a marcadores tumorais em diferentes órgãos. O objetivo deste trabalho foi a purificação da calicreína tecidual do rato (rK1), isolada da glândula submandibular, a caracterização cinética da sua inibição pela aprotinina e a comparação dos resultados obtidos com dados publicados na literatura. A rK1 foi purificada a partir do pó liofilizado de 300 glândulas submandibulares de ratos Wistar adultos rK1. A purificação constou de: preparação do extrato bruto, seguida de três cromatografias, a saber: cromatografia de troca iônica em coluna de DEAESepharose, cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-aprotinina ecromatografia de filtração molecular em coluna de Superose 12 HR 10/30 em equipamento FPLC. Proteínas foram dosadas segundo Bradford, 1976 e a atividade amidásica foi determinada com o substrato Bz-Arg-Nan, segundo Erlanger et al., 1961. O fator de purificação foi de 32 vezes e o rendimento foi de 5%. Como critérios de pureza, foram realizadas a eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente 5-15% e SDS 0,1% e a espectrometria de massa. A massa molecular da rK1 foi de 28 kDa. A titulação da solução da rK1 purificada com a aprotinina revelou uma concentração de 692 nM, em centro ativo. A18 hidrólise do substrato D-Val-Leu-Arg-Nan, catalisada pela rK1, em pH 9,0, 37oC, foi estudada na ausência e na presença de concentrações crescentes de aprotinina. Os resultados mostraram que a hidrólise seguiu à cinética de Michaelis-Menten na faixa de concentrações do substrato utilizadas (120 a 640 mM). Os valores calculados de Km e kcat foram 104,2 + 24,6 mM e 8641 + 572 min-1, respectivamente. A inibição da rK1 pela aprotinina é competitiva parabólica, um tipo raro de inibição, onde duas moléculas de aprotinina se ligam a uma moléculada enzima. Os valores calculados de Ki e Kii foram 26,4 + 12 nM e 16,9 8,8 nM, respectivamente. A inibição da hK1 pela aprotinina, com o substrato D-Val-Leu-Arg-Nan, é competitiva parabólica e, portanto, semelhante à inibição da calicreína tecidual humana (hK1) com o mesmo substrato.
Resumo em lingue estrangeira: Kallikreins are a group of serine proteases that play an important role in many physiologic processes depending on the tissue end conditions of expression. They are found in pancreas, salivary glands, intestine, kidneys, pituitary gland, plasma and other tissues. Many kallikreins seem to be related in many pathologic processes, including in central nervous system (CNR), such as epilepsy and Alzheimer, and cancer, being, therefore, future biomarkers for tumours of different organs. The aim of this study was to stablish the kinetic model of the inhibition of rat tissue kallikrein, isolated from submandibulary glands, by aprotinin and tocompare the results with data from literature. Lyophilized powder was obtained from three hundred submandibulary glands extracts of adults Wistar rats and rK1 was purified by DEAE-Sepharose, Sepharose-aprotinin and gel filtration Superose 12 HR column chromatographies. The protein concentration was determined byBradford method (1976) and the rK1 amidasic activity was determinated with Bz- Arg-Nan as substrate. The purification factor was 32 with 5% recovery. Electrophoresis was performed using 5-15% gradient polyacrilamide gel and 0,1% SDS. Mass spectrometry was also accomplished. Both methods showed a pure rK1 corresponding to Mr 28000 approximately. Purified rK1 was titrated with aprotinin and its active center concentrations, was 692 nM. Hydrolysis of D-Val- Leu-Arg-Nan by rK1, at pH 9.0 and 37oC, was carried out in the absence and in thepresence of increasing concentrations of aprotinin. The results showed that the hydrolyses followed Michaelis-Menten kinetics on the wide range of substrate concentration (120-640 mM). Km and kcat values are 104.2 + 24.6 and 8641 + 572 20 min-1, respectively. The data indicated that inhibition of rK1 by aprotinin is not asimple competitive inhibition, but that it is a competitive inhibition of the parabolic type. Parabolic competitive inhibition is a rare type of enzyme inhibition, in wich two aprotinin molecules binds to one rK1 molecule. The calculated values of the constants Ki and Kii were, 26.4 + 12.0 and 16.9 + 8.8 nM, respectively. Parabolic competitive inhibition was also reported for the hK1 inhibition by aprotinin with DVal-Leu-Arg-Nan as substrate.
URI: http://hdl.handle.net/1843/NCFA-7NPK27

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